BAGAIMANA UJIAN PENGESAHAN COVID-19 DILAKUKAN?

COVID-19 diakibatkan oleh jangkitan virus SARS-CoV-2. Setakat ini masih tiada vaksin atau ubatan khusus buat mengatasi jangkitan tersebut. Ketika awalnya, pengesanan bagi jangkitan adalah sukar. Mujurlah saintis di China cepat dapat membuat analisis jujukan genom virus SARS-CoV-2 (ketika itu masih dikenali sebagai nCoV-2019) dan didepositkan kepada BioRXiv.org.

Tindakan cepat analisis pasukan China tersebut membolehkan pelbagai negara bersiap siaga mengembleng tenaga untuk mengenali dan melawan virus yang telah tersebar sebagai pandemik ini.

Terutama bagi pengesanan jangkitan awal. Setakat ini pengesanan jangkitan SARS-CoV-2 adalah menggunakan teknik RT-PCR (rRT-PCR / qRT-PCR).

VIRUS SARS-CoV-2

Sebelum membincangkan teknik pengesanan virus SARS-CoV-2, mari mengenali virus ini dengan lebih dekat. Nak kesan, kena kenal dulu. Ye tak?

SARS-CoV-2 adalah virus dari famili Coronaviridae, genus Betacoronavirus dan sub-genus Serbecovirus (Lineage b).

Virus ini ringkas sahaja. Strukturnya terdiri dari:

• Protein Spike (yang kita telah bincangkan Panjang lebar dalam artikel semalam: )

• Protein E (envelope)

• Protein M (membrane)

• Protein N (nucleocapsid)

Protein N membentuk struktur yang melindungi genom (jujukan gen) virus, protein S, E dan M membentuk struktur yang melitupi virus.

Genom virus ini hanya mempunyai 30 000 nukleotida dalam bentuk RNA jujukan tunggal, rantaian positif (positive-sense single-stranded RNA). Sebagai perbandingan, manusia mempunyai jujukan genom sepanjang 3 billion nukleotida, DNA jujukan ganda dua (double stranded DNA).

Jujukan genom SARS-CoV-2 terdiri dari: ORF1a/b yang mengekodkan dua polyprotein (pp1a dan pp1b) dan 16 protein bukan struktur seperti RdRp, ORF yang lain mengekodkan protein struktur dan protein aksesori dalam pembikinan progeny virus baru.

Juga jujukan kod bagi protein S, E, M dan N yang sangat penting bagi virus seperti yang dijelaskan diatas.

TEKNIK RT-PCR

Teknik RT-PCR menggunakan prinsip mengamplifikasi (mengganda) jujukan DNA spesifik dan bilangan amplifikasi tersebut dikesan terus menggunakan pengesan fluoresen pada mesin. Jadi, jika ada satu jujukan DNA pun ianya boleh dikesan.

Jujukan DNA digunakan sebagai templat (acuan?). Enzim polymerase digunakan sebagai pemangkin utuk memangkinkan tindakan pempolimeran DNA mengikut templat DNA asal tersebut.

Dalam kaedah ini perkara yang perlu ada:

Template DNA (yang ingin dikesan)

Primer (yang mengenal sebahagian kecil templat DNA secara spesifik)

Enzim polymerase (yang memangkinkan tindakbalas pempolimeran (pemanjangan DNA)

Molekul fluoresen (yang memberikan signal bagi pengesan ‘mengira’ bilangan DNA yang telah diamplifikasi.)

Mesin thermal cycler yang boleh menaikturun suhu dengan cepat, sepantas beberapa saat untuk menaikkan suhu 50 darjah selsius kepada 90 darjah selsius. Dan pantas menurunkan kembali keangka 60 darjah selsius, contohnya.

TEKNIK PENGESANAN SARS-CoV-2

Jujukan genom virus SARS-CoV-2 perlu dipencilkan dari sampel sputum, calitan tekak dan hidung sebelum dapat dimasukkan kedalam tiub reaksi PCR. Jujukan RNA dalam sampel akan dipencilkan kesemuanya melalui teknik pemencilan yang mudah.

Tetapi, jujukan ini adalah dalam bentuk RNA. Jadi ia perlu ditukarkan kebentuk jujukan DNA menggunakan teknik transkripsi berbalik (reverse transcription) supaya PCR dapat dilakukan.

Ingatkah anda?

Sampel tadi adalah dari calitan tekak dan sputum. Jadi bukan hanya ada jujukan genom SARS-CoV-2 sahaja, cebisan gen dari sel tekak kita, salinan genom dari bakteria dan virus lain dari tekak dan hidung kita juga akan ada bercampur dalam sampel tersebut.

Tidak mengapa. Teknik ini amat spesifik mengesan hanya target yang telah kita tentukan sahaja. Dengan syarat, primer yang digunakan adalah spesifik. Contohnya begini:

Bayangkan artikel ini adalah jujukan yang mengekod genom SARS-CoV-2. Kita pilih jujukan DNA SARS-CoV-2 yang digunakan sebagai templat adalah ayat ini:

SAYAADABOLAWARNAPUCUKPISANGTUA

Dalam artikel yang panjang ini, hanya ada satu sahaja jujukan tersebut bukan? Ia adalah unik. Sebab itu kita memilihnya. Begitu juga sebahagian dari genom SARS-CoV-2, kita pilih jujukan yang unik sebagai target bagi templat.

Jika diselidiki seluruh artikel-artikel yang pernah diterbit dalam ISB selama ini, akan ada satu sahaja padanan.

Jadi kita boleh gunakan SAYAADABOLAWARNAPUCUKPISANG dalam ‘finder’ atau Google untuk mencari artikel ini dari ratusan artikel lain. Begitulah spesifiknya teknik RT-PCR ini.

Kemudian, dalam kit pengesanan yang telah tersedia sebenarnya ada primer khusus bagi mengesan jujukan tersebut. Primer adalah seperti jujukan yang mengesan templat unik tersebut. Contohnya begini:

SAYAADABOLAWARNAPUCUKPISANG -templat

SAYAADABOLA -primer

Jujukan ‘’SAYAADABOLA’ berfungsi sebagai primer yang mengesan kewujudan templat jujukan SAYAADABOLAWARNAPUCUKPISANG dalam artikel ini. Primer SAYAADABOLA adalah sangat unik mengesan jujukan tersebut. Primer ini digelar forward primer.

Kehadiran enzim polymerase pula akan membuat pemanjangan dari primer tersebut bagi melengkapkan jujukan sehingga SAYAADABOLAWARNAPUCUKPISANG lengkap.

Ada satu lagi primer yang digelar ‘reverse primer’. Primer ini akan mengamplifikasi jujukan ini dari arah belakang.

SAYAADABOLAWARNAPUCUKPISANG - templat

CUKPISANG – primer

Jadi, jujukan yang akan diampilifikasi adalah:

SAYAADABOLAWARNAPUCUKPISANG

Tidaklah ia merewang dan meraban mengamplifikasi seluruh jujukan genom yang panjang. Macam tercopy separuh artikel dari SAYAADABOLA ke? Rugilah.

Suhu dinaikkan tinggi supaya templat tersebut ,yang kini mengganda dua (sebagai double strand DNA), akan tercerai dan menjadi templat tindakbalas seterusnya.

Keseluruhan tindakbalas ini dilakukan berulang-ulang, sehingga kebarangkalian padanan ini adalah tidak spesifik, separa padanan atau hanya artifak tidakbalas dapat disingkirkan.

Molekul fluoresen digunakan bagi mengikuti proses ini supaya dapat dikesan oleh pengesan fluoresen mesin RT-PCR tersebut. Contohnya prob SYBRGreen yang akan menelusup ke celah DNA double strand dan menghantar signal fluoresen.

Bila tindak balas berulang-ulang ini dihentikan, dapatlah dikesan keamatan total yang dihasilkan oleh bilangan templat ganda dua yang terhasil.

Hanya ada satu jujukan genom dari satu virus (secara teorinya) dapat dikesan melalui teknik ini. Jadi, jika baru dijangkiti oleh SARS-CoV-2 semalam pun dapat dikesan POSITIF.

Pengesanan terhadap SARS-CoV-2 biasanya dilakukan terhadap tiga gen berasingan. Contohnya salah satu pengesanan dari Korea menggunakan primer terhadap N gene, RdRP gene yang dikodkan oleh ORF1a/b, Sarbecovirus (E gene) yang menunjukkan kehadiran virus dari famili Coronaviridae

Kepantasan pasukan China menghasilkan jujukan genom SARS-CoV-2 serta berkongsi maklumat ini secara maya kepada seluruh dunia adalah amat dipuji. Tindakan tersebut membolehkan pelbagai pihak di seluruh dunia mencipta jujukan primers dan teknik PCR yang optimum bagi pengesanan pantas virus ini.

Jika benarlah virus ini angkara China, sudah pastilah mereka tidak akan sudi memberikan maklumat tersebut sepantas itu. Jika ini angkara Eropah, tidaklah Italy dan beberapa negara lain tersungkur menyerah tiada kelengkapan pengesanan yang cukup. Jika angkara USA, tidaklah mereka juga terkalut-kalut mahu kit pengesanan yang cukup dan melobi vaksin dari Germany.

Boleh lihat video ini untuk tindakbalas RT-PCR yang lebih jelas: https://m.youtube.com/watch?v=GCzH2Wcvd8E

#cisplatin

#CovidAwarenessISB

RUJUKAN

Al-Tawfiq JA, Memish ZA. Diagnosis of SARS-CoV-2 Infection based on CT scan vs. RT-PCR: Reflecting on Experience from MERS-CoV. Journal of Hospital Infection. 2020 Mar 6.

Hirotsu Y, Mochizuki H, Omata M. Double-Quencher Probes Improved the Detection Sensitivity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by One-Step RT-PCR. medRxiv. 2020 Jan 1.

Konrad R, Eberle U, Dangel A, Treis B, Berger A, Bengs K, Fingerle V, Liebl B, Ackermann N, Sing A. Rapid establishment of laboratory diagnostics for the novel coronavirus SARS-CoV-2 in Bavaria, Germany, February 2020. Eurosurveillance. 2020 Mar 5;25(9).

Liu R, Han H, Liu F, Lv Z, Wu K, Liu Y, Feng Y, Zhu C. Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020. Clinica Chimica Acta. 2020 Mar 7.

Pfefferle S, Reucher S, Nörz D, Lütgehetmann M. Evaluation of a quantitative RT-PCR assay for the detection of the emerging coronavirus SARS-CoV-2 using a high throughput system. Eurosurveillance. 2020 Mar 5;25(9).

Diposting Semula Daripada Laman FB : Ini Sains Beb